اقترح الباحثون طريقة للحصول بسرعة على البروتين الذي يلعب دورًا مهمًا في آلية إصابة الخلايا بفيروس كورونا

على الرغم من أن فيروس SARS-CoV-2، المسبب لمرض كوفيد-19، قد حصل على حالة الفيروس الأكثر دراسة، إلا أنه ليس من الواضح تمامًا بعد كيفية اختراقه للخلية المضيفة. من المعروف أن البروتين الشوكي لفيروس كورونا (بروتين سبايك) يشارك بنشاط في عملية العدوى، لكن مجاله عبر الغشاء – الجزء الذي يخترق غلاف الفيروس – لا يزال قيد الدراسة نسبيًا. إن دراسة TMD معقدة بسبب وجود السيستين في بنيتها الأولية (سلسلة من بقايا الأحماض الأمينية المتصلة بسلسلة)، والتي تحب التفاعل كثيرًا. وبسبب هذا، تتشابك جزيئات البروتين مع بعضها البعض (تشكل جسور ثاني كبريتيد) وتترسب، مما يتداخل مع التجربة. في السابق، تم حل هذه المشكلة جذريًا: لتجنب التكتل، تم تغيير البنية الأساسية للبروتين عمدًا (تم إدخال الطفرات). ومع ذلك، اتخذ العلماء الروس من MIPT وزملاؤهم نهجا أكثر دقة. لقد احتفظوا بالبنية الأولية للنوع البري (الطبيعي)، دون استبدال السيستين بأحماض أمينية أخرى، كما فعلوا في دراسات أخرى. وبدلاً من ذلك، سيطروا على العمليات الكيميائية، و”فتحوا” الروابط غير الضرورية، وحافظوا على بنية البروتين سليمة لإجراء المزيد من الأبحاث. نُشرت الدراسة في مجلة الكيمياء الحيوية (موسكو)، سلسلة الملحق أ: الأغشية وبيولوجيا الخلية. لتحقيق هذا الهدف، استخدم العلماء الروس طريقة غير عادية لتخليق البروتين، بالإضافة إلى تبسيط عملية تنقيته. في الدراسات السابقة، تم إنتاج البروتين باستخدام الخلايا الحية (نظام تعبير بكتيري قياسي)، لذلك كان لا بد من استخدام طرق تنقية معقدة متعددة الخطوات، والتي يمكن أن تؤثر بشكل مباشر على كيفية تجميع البروتين في أداة القطع. لتجنب ذلك، قام علماء الفيزياء الحيوية من MIPT وزملاؤهم بتصنيع بروتين SARStm بدون طفرات باستخدام طريقة التعبير الخالي من الخلايا، وإضافة مادة وراثية (البلازميدات) مباشرة إلى المستخلص البكتيري النهائي الذي يحتوي على جميع مكونات تجميع البروتين. وقد أتاح النهج الجديد الحصول على البروتين المستهدف بشكل أسرع من إنتاج الخلايا الحية وتقليل خطوات التنقية. ميزة أخرى للتعبير الخالي من الخلايا هي تجميع البروتين مباشرة من الأحماض الأمينية “الموسومة بالنظائر”. وهي تختلف في أنه في تكوين الأحماض الأمينية يتم استبدال ذرات الكربون والنيتروجين المعتادة (¹²C و¹⁴N) بنظائر أثقل (¹³C و¹⁵N). بفضل النيوترون “الإضافي”، تكتسب النواة عزمًا مغناطيسيًا وتصبح “مرئية” أثناء البحث باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR). يتيح لك نظام العلامات استعادة بنية البروتين بدقة عالية. للحصول على بروتين مُسمى باستخدام بكتيريا حية، يجب زراعته على وسائط مغذية مع إضافة الجلوكوز والأمونيا الموسومة بالنظائر، وهو أكثر تكلفة. أوضحت صوفيا سوداريفا، الباحثة المبتدئة في مختبر الشيخوخة وأمراض التنكس العصبي المرتبطة بالعمر في مركز أبحاث الآليات الجزيئية للشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر في MIPT: “كان الهدف الرئيسي لعملنا هو محاولة اختيار الظروف للتعبير وتنقية البروتين من النوع البري، أي بتسلسل الأحماض الأمينية الطبيعية دون أي تغييرات”. — بشكل قياسي، بعد التعبير، نقوم بإذابة البروتين في جزيئات المنظف الأيوني، لورويل ساركوسينات (LS). وتبين أن الصعوبة تكمن في أنه حتى مع التسخين الشديد إلى +95 درجة مئوية، لم يصل المركابتويثانول إلى البروتين الموجود في هذه المذيلات، مما كان ينبغي أن يفتح جسور السيستين، والتي من شأنها أن ترفع البروتين من الرواسب. وقد ساعدنا التعرض لفترة طويلة عند درجة حرارة +4 درجة مئوية، وهو أمر غير متوقع تمامًا. بعد تنقية البروتين الموجود في مذيلات لوريل ساركوسينات (LS) من الشوائب، قام العلماء عمدًا بتعطيل المذيلات لتحرير البروتين النقي وعزله. ونتيجة لذلك، تم الحصول على بروتين ¹³C/¹⁵N SARStm عالي النقاء ذو علامة نظائرية. كان ناتجه 0.3 مجم من 1 مل من خليط التفاعل – ليس الحد الأقصى، ولكنه كمية كافية للتحليل اللاحق. ثم تمت إعادة تعبئته في مذيلات دوديسيل فسفوكولين جديدة. تخلق هذه المذيلات بيئة داخل نفسها مشابهة للطبقة الدهنية من غشاء الخلية، مما يسمح للبروتين الكاره للماء بأخذ الشكل الصحيح والعملي وإعداده للدراسة بواسطة الرنين المغناطيسي النووي. أكد تحليل الرنين المغناطيسي النووي للبروتين المنقى ملاءمته لمزيد من الدراسات الهيكلية. يعد البروتوكول المطور بديلاً أكثر سهولة وأسرع للطرق التقليدية لإنتاج البروتين للبحث. إنه لا يسمح فقط بتجنب زراعة البكتيريا باهظة الثمن على الوسائط ذات العلامات، وذلك باستخدام الأحماض الأمينية ذات العلامات المباشرة، ولكن أيضًا العمل مع البروتينات “المتقلبة”. وسيهدف العمل الإضافي إلى زيادة إنتاج البروتين المستهدف، وحساب بنيته ثلاثية الأبعاد وتحديد آلية اختراق الفيروس للخلية باستخدام هذا “المرساة”.